土壤微生物檢測對土壤微生物進(jìn)行研究的方法

在陸地生態(tài)系統中，在土壤微生物檢測土壤中生活有數量龐大的微生物種群，包括原核微生物如細菌、藍細菌、放線(xiàn)菌及超顯微結構微生物, 以及真核生物如真菌、藻類(lèi)( 藍藻除外) 、地衣等。它們與植物和動(dòng)物有著(zhù)明確的分工，主要扮演“分解者”的角色，幾乎參與土壤中一切生物和生物化學(xué)反應。由于土壤微生物的復雜性、土壤本身的多變性和研究方法不完善等原因的限制, 以往人們對土壤微生物多樣性的研究與動(dòng)、植物相比遠遠落后。隨著(zhù)多聚酶鏈反應(PCR)、核酸測序等現代生物學(xué)分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展,人們對土壤微生物多樣性有了更多的了解；高通量測序技術(shù)的發(fā)展則為研究土壤宏基因組提供了大量數據，為直接探究土壤中的微生物群落結構提供了客觀(guān)而全面的信息。
1、土壤微生物檢測微生物平板培養法
傳統的土壤生態(tài)系統中微生物群落多樣性及結構分析大多是將微生物進(jìn)行分離培養，然后通過(guò)一般的生物化學(xué)性狀，或者特定的表現型來(lái)分析，局限于從固體培養基上分離微生物。這種方法只限于極少量（0.1%-1%）可以培養的微生物類(lèi)群，無(wú)法對絕大多數微生物的分類(lèi)地位和系統發(fā)育關(guān)系的深入研究。
2、分子生物學(xué)技術(shù)結合測序的方法
在過(guò)去的20多年里，分子生物學(xué)技術(shù)，尤其16SrDNA技術(shù)已經(jīng)廣泛應用于鑒定未知菌的研究中。20世紀80年代以來(lái), 逐步建立起了以分子系統發(fā)育分析為基礎的現代微生物分子生態(tài)學(xué)的研究方法,使得研究者能夠在分子水平上對土壤微生物多樣性進(jìn)行研究。其中運用比較廣泛并被普遍認可的是PCR-DGGE/TGGE法。DGGE/TGGE 的局限性在于，檢測的DNA片段長(cháng)度范圍以200bp ～900bp為佳，超出此范圍的片段難以檢測[4]，PCR 擴增所需G/C 堿基對含量至少達40 % ，通常只能檢測到環(huán)境中優(yōu)勢菌群的存在，只有占整個(gè)群落細菌數量約1％或以上的類(lèi)群能夠通過(guò)DGGE檢測到[5]。TGGE 儀器所允許的溫度范圍為15 ℃～80 ℃，較大片段DNA 的Tm 值因為接近80 ℃而使檢測難度提高；若電泳條件不適宜，不能*保證將有序列差異的DNA片段分開(kāi)，從而出現序列不同的DNA 遷移在同一位置的現象。
3、高通量測序方法
研究表明，400～600堿基的序列，足以對環(huán)境中微生物的多樣性和種群分類(lèi)進(jìn)行初步的估計[8]，因此454高通量測序的方法因其讀長(cháng)（400~500bp）長(cháng)和準確性高的特點(diǎn)大量用于微生物多樣性的研究。有了微生物16S rDNA序列，不論是全長(cháng)還是部分，都可以提交到GenBank采用BLAST程序與已知序列進(jìn)行相似性分析。Gen Bank將按照與測得序列的相似性高低列出已知序列名單、相似性程度以及這些序列相對應的微生物種類(lèi)，但更為的微生物分類(lèi)還取決于系統發(fā)育分析高通量測序的*性體現在：測序序列長(cháng)，可以覆蓋16S /18S rDNA、ITS等高變區域； 測序通量高，可以檢測到環(huán)境樣品中的痕量微生物；實(shí)驗操作簡(jiǎn)單、結果穩定，可重復性強；無(wú)需進(jìn)行復雜的文庫構建，微生物DNA擴增產(chǎn)物可以直接進(jìn)行測序，實(shí)驗周期短；測序數據便于進(jìn)行生物信息分析。該方法得到*期刊的認可（Nature等），已成為土壤微生物多樣性檢測的重要手段。上海美吉生物公司已有若干成功案例，為客戶(hù)提供的土壤樣本進(jìn)行高通量測序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。高通量測序因其數據量大，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，盡可能避免了繁瑣的實(shí)驗操作過(guò)程所造成的樣本損失，能夠相對客觀(guān)的反應出土壤樣本的真實(shí)情況。